科普：生物大分子液質(zhì)聯(lián)用檢測的變性條件是什么？廣州

在利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）分析蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子時(shí)，變性（Denaturation）是一個(gè)極其關(guān)鍵的樣品前處理步驟。其核心目的是破壞生物大分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)（二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)），使其線性展開。這對于后續(xù)的分析至關(guān)重要，原因如下：

1.暴露酶切位點(diǎn)：蛋白質(zhì)通常需要被特定的蛋白酶（如胰蛋白酶）切割成更小的肽段才能被質(zhì)譜有效分析和鑒定。天然折疊的蛋白質(zhì)會(huì)隱藏其酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致酶切效率低下甚至失敗。變性使蛋白質(zhì)伸展，讓酶切位點(diǎn)充分暴露。

2.提高溶解度：某些蛋白質(zhì)或復(fù)合物在天然狀態(tài)下溶解度差，容易聚集沉淀。變性劑有助于溶解這些難溶性組分。

3.破壞非共價(jià)相互作用：變性打斷蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵、疏水相互作用等，瓦解其緊密結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的還原和烷基化步驟創(chuàng)造條件。

4.滅活蛋白酶/酶：高溫或強(qiáng)變性劑能有效滅活樣品中可能存在的內(nèi)源性蛋白酶，防止它們在后續(xù)處理中降解目標(biāo)蛋白。

常用的變性條件

生物大分子LC-MS/MS檢測中常用的變性條件主要依賴于化學(xué)變性劑和熱變性：

1.強(qiáng)變性劑：

*尿素（Urea）：常用濃度6-8M。通過破壞氫鍵網(wǎng)絡(luò)使蛋白質(zhì)變性。優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，使用廣泛。注意：高溫下（>37°C）尿素會(huì)分解產(chǎn)生異氰酸酯，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基甲?；ㄒ环N非酶修飾），干擾后續(xù)分析，因此通常避免高溫長時(shí)間處理。

*鹽酸胍（GuanidineHydrochloride,GuHCl）：常用濃度6-8M。變性能力比尿素更強(qiáng)，能更有效地溶解難溶蛋白和破壞疏水核心。它同樣能抑制蛋白酶活性。相比尿素，在高溫下更穩(wěn)定，不易產(chǎn)生副反應(yīng)。

*十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，常用濃度0.1%-2%。通過破壞疏水相互作用并包裹蛋白質(zhì)使其帶負(fù)電荷而變性溶解。關(guān)鍵點(diǎn)：SDS會(huì)嚴(yán)重干擾質(zhì)譜電離和色譜分離，必須在酶切前徹底去除（通常通過沉淀、過濾或強(qiáng)離子交換色譜除鹽柱實(shí)現(xiàn)）。

2.還原劑（輔助變性并打斷二硫鍵）：

*二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）：常用濃度5-20mM。這些還原劑能打斷維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的二硫鍵（-S-S-），將其還原為巰基（-SH），是變性不可或缺的搭檔。通常在變性劑存在下加入。

3.熱變性：

*將樣品在含有變性劑/還原劑的緩沖液中加熱（通常90-100°C，5-15分鐘），能更快速、徹底地破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，尤其對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)有效。使用鹽酸胍時(shí)更常結(jié)合高溫處理。

典型流程順序：通常先加入變性劑和還原劑（常結(jié)合熱變性）使蛋白質(zhì)完全變性、還原（打斷二硫鍵），然后進(jìn)行烷基化（常用碘乙酰胺IAA或碘乙酸IAM，濃度10-50mM，室溫避光反應(yīng)20-30分鐘），將暴露的巰基（-SH）烷基化封閉，防止其重新形成二硫鍵。最后，在酶切前可能需要稀釋或更換緩沖液（特別是使用尿素時(shí)，需降低濃度至<2M以下，因?yàn)楦邼舛饶蛩貢?huì)抑制胰蛋白酶活性）。

廣州中森檢測的蛋白解離方法

廣州中森檢測作為專業(yè)的第三方檢測機(jī)構(gòu)，其蛋白質(zhì)組學(xué)或靶向蛋白質(zhì)分析服務(wù)中采用的蛋白解離（通常指包含變性、還原、烷基化的完整前處理流程）方法，會(huì)嚴(yán)格遵循科學(xué)規(guī)范和項(xiàng)目需求。雖然具體內(nèi)部優(yōu)化流程可能不公開，但可以預(yù)期他們會(huì)采用行業(yè)廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)方法，核心步驟通常包括：

1.裂解：使用含有強(qiáng)變性劑（如8M尿素或6M鹽酸胍）和還原劑（如5-10mMDTT或TCEP）的裂解緩沖液處理樣品（細(xì)胞、組織等），充分裂解細(xì)胞、溶解蛋白并變性還原。此步驟常結(jié)合超聲破碎（助溶）和加熱（如95°C，5-10分鐘）。

2.烷基化：在還原后加入烷基化試劑（如20-50mMIAA），室溫避光反應(yīng)以封閉巰基。

3.緩沖液置換/稀釋：尤其在使用尿素時(shí)，會(huì)通過稀釋、超濾或緩沖液置換（例如使用除鹽柱）將溶液環(huán)境調(diào)整到適合后續(xù)酶切的條件（如降低尿素濃度至<2M，或換成Tris-HCl等緩沖液，pH~8.0）。

4.酶切：加入胰蛋白酶（或其他蛋白酶），在適宜溫度（通常37°C）下進(jìn)行過夜酶解，將蛋白質(zhì)切割成肽段混合物。

總結(jié)：變性是LC-MS/MS蛋白質(zhì)分析成功的基礎(chǔ)。通過合理使用變性劑（尿素/鹽酸胍/SDS）、還原劑（DTT/TCEP）和熱處理的組合，并配合嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪€原、烷基化流程，才能確保蛋白質(zhì)被充分解離、酶切，最終獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于定性和定量分析。廣州中森檢測等專業(yè)機(jī)構(gòu)會(huì)依據(jù)樣品類型和檢測目標(biāo)，優(yōu)化并執(zhí)行這些關(guān)鍵的前處理步驟。