外泌體分離提取方案。主要方案包括:
1、差速超1速離心法;
適用于細(xì)胞上清、灌洗液、尿液等大體積的樣品;
2、基于PEG沉淀原理的試劑盒法;
適用于血1清、腦脊液等小體積的樣品;
3、超濾提取法;
適用于細(xì)菌培養(yǎng)液或外泌體含量較低的樣品濃縮。亦可搭配超1速離心法,做進(jìn)一步的提取。
外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種,外泌體,其膜來源與粒徑范圍與細(xì)胞外囊泡相似,電鏡下,顯示出典型的茶托狀超微結(jié)構(gòu)。實(shí)際操作中,通過常規(guī)的單一的方法很難鑒定外泌體。鑒定外泌體需要包含形態(tài)、粒徑、表面分子標(biāo)記物等多方面的鑒定。具體方法包括:透射電鏡(形態(tài)鑒定)、NTA檢測(cè)(粒徑及濃度鑒定)、WB(分子標(biāo)志物)。NTA檢測(cè)作為外泌體鑒定的經(jīng)典方法之一,可同時(shí)反映出檢測(cè)樣品的濃度及粒徑。質(zhì)量較好,純度較高的外泌體樣品,粒徑分布在30-150nm,原液濃度在10^9左右。為了保證檢測(cè)質(zhì)量,外泌體測(cè)試服務(wù),對(duì)每一個(gè)樣品,都會(huì)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。檢測(cè)周期為2-3個(gè)工作日,可當(dāng)天到樣當(dāng)天出結(jié)果。
樣本準(zhǔn)備
1. 提供外泌體懸液即可,未純化樣本也可以上機(jī)檢測(cè);
注意:NTA僅提供粒徑分布情況和顆粒濃度,無法區(qū)分外泌體與非外泌體成分;當(dāng)然也可先利用外泌體特異性標(biāo)記物進(jìn)行熒光標(biāo)記,則可以獲知外泌體特定亞群的含量。
2.儀器的檢測(cè)區(qū)間是10^7 particles/ml,且有濃度檢測(cè)下限,為10^5 particles/ml,進(jìn)樣量不少于2ml;一般來說,會(huì)對(duì)樣本稀釋后進(jìn)樣;
我司無法準(zhǔn)確建議送樣量;檢測(cè)需要量與樣本本身濃度有關(guān),樣本濃,則用量小,反之則多,根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn),樣本取用量一般在2μl-100μl不等,取用量大于50μl時(shí)大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對(duì)樣本有過多稀釋。一般建議送樣量不低于30μl,如樣本珍貴,可聯(lián)系我司寄回,運(yùn)費(fèi)視具體情況收取。
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