一. 原位雜交天
1. 重新水化和固定
1) 吸取固定好的胚胎,加入50%的PBST溶液,原位雜交技術(shù),放置5分鐘。
2) 置換成30%的PBST溶液,放置5分鐘
3) 置換成PBST溶液,放置5分鐘,重復(fù)一次
4) 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。
蛋白酶處理與后固定(本實驗不做此步)
1) 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理,5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘,24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩,可以不用或者少用蛋白酶處理,發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織,以便于雜交。
2) 用PBST溶液輕洗,在PBST中放置5分鐘。
3) 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘,室溫。
4) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。
組織原位雜交(Tissue in situ hybridization),即原位雜交組織化學(xué)技術(shù)和原位雜交細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
原位雜交技術(shù)的基本原理
利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序,通過堿基對之間非共價鍵的形成,出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū),形成雜交的雙鏈。
1.兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,通過氫鍵結(jié)合,形成DNA-DNA、DNA一RNA或RNA一RNA雙鍵分子
2.應(yīng)用帶有標(biāo)記的(有性同位素,如3H、35S、32P,熒光素、生物素、等非性物質(zhì))DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交
3.用自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位
用原位雜交術(shù),可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。
此方法有很高的敏感性和特異性,可進一步從分子水來探討細(xì)胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。
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