原位雜交雜交液注意事項:
(1)雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等。
(2)雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低,雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA:RNA,RNA:DNA,DNA:DNA的雜交溫度降低0.35℃,0.5℃和0.65℃。,所以雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達(dá)到提高雜交率的目的(尤其對雙鏈核酸探針)。
在雜交液中加入牛血1清白蛋白及載體DNA或RNA等,分子病理技術(shù)服務(wù),都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合,以減低背景。
將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到纖維素濾膜上
(1) 在含有選擇性的瓊脂平板上放一張纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點)。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。后,在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于纖維素濾膜。
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