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武漢科銳諾生物科技有限公司

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點(diǎn)對(duì)點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程

1、誘餌蛋白毒性及自激1活檢測(cè);

2、共轉(zhuǎn)化:分別將誘餌/捕獲質(zhì)粒(pGBKT7-Bait/pGADT7-Prey)、陽性對(duì)照質(zhì)粒(pGBKT7-p53/pGADT7-T)、陰性對(duì)照質(zhì)粒(pGBKT7-Lam/pGADT7-T)分別共轉(zhuǎn)到Y(jié)2H Gold感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于DDO平板培養(yǎng);

3、點(diǎn)板驗(yàn)證:分別從平板上挑單克1隆稀釋10倍、100倍、1000倍,然后點(diǎn)板到TDO/X/A和QDO/X/A固體培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證;

4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與報(bào)告整理。

首先,分子病理診斷為的診斷及鑒別診斷提供了依據(jù),當(dāng)遇到少見疑難或罕見病例時(shí),尤其是通過形態(tài)學(xué)和免yi組化染色仍不能確定的類型,tunel檢測(cè)服務(wù),這時(shí)候就需要借助分子病理技術(shù),從基因水平來判斷疾病的異常情況,協(xié)助病理醫(yī)生作出相對(duì)準(zhǔn)確的診斷并判斷該疾病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。應(yīng)用領(lǐng)域廣泛的要數(shù)軟組織和骨、淋巴造血系統(tǒng),因?yàn)檫@些系統(tǒng)的相似而不同,單靠鏡下表現(xiàn)和已知的已無法滿足診斷需求。另外,分子病理檢測(cè)也常常運(yùn)用在分子分型中,比如大家熟知的分子分型,通過基因表達(dá)譜研究,可將分為管腔A型、B型,HER-2陽性型,基底樣型。

雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘,并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次,同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。

把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號(hào)面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。

用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。

底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記??蓮牡灼先∠峦该骷?,通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。

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